Hand hygiene merupakan salah satu faktor penting dalam melaksanakan pencegahan terjadinya infeksi di rumah sakit dan perawat harus melakukan five moment hand hygiene karena perawat berinteraksi langsung dengan pasien 24 jam. Supervisi merupakan bagian dari pengarahan, yang berperan untuk mempertahan kan segala kegiatan yang telah diprogramkan untuk dilaksanakan dengan baik. Penelitian ini dilakukan Di Rawat Inap Rumah Sakit Amal Sehat Wonogiri dengan metode pendekatan quasi eksperimen dengan one grup pretest dan posttest design. Populasi pada penelitian ini adalah 72 perawat dan didapatkan sampel 42 perawat, dengan menggunakan simple random sampling. Instrument penelitian menggunakan quisioner dan lembar supervisi kepatuhan five moment hand hygiene, kemudian data dianalisa menggunakan uji Mc-Nemar. Hasil penelitian kepatuhan five moment hand hygiene sebelum dilakukan intervensi supervisi sebagian besar responden patuh terhadap five moment hand hygiene sebanyak 26 responden (61,9%). Sedangkan setelah dilakukan intervensi supervisi hampir semua responden patuh dalam melakukan five moment hand hygiene sebanyak 38 responden (90,5%). Hasil analisis menunjukan bahwa supervisi dapat meningkatkan kepatuhan five moment hand hygiene, dibuktikan dengan p value 0,004 yang berarti 0,004 < α= 0,05. Dari hasil penelitian ini didapatkan ada 2 responden yang sebelum dilakukan supervisi tidak patuh dan setelah dilakukan supervisi tetap tidak patuh dikarenakan kurang pengetahuan, pemahaman dan pengalaman karena responden masih tergolong karyawan baru sehingga belum memiliki kebiasaan cuci tangan yang konsisten. Kesimpulan dari penelitian ini adalah supervisi efektif untuk meningkatkan kepatuhan perawat di unit rawat inap dalam melakukan five moment hand hygiene. Saran bagi rumah sakit untuk lebih mendorong dan mendukung keberlangsungan supervisi dengan pengembangan lebih lanjut serta memberikan dukungan yang lebih besar.